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生物反应器规模生长与NMN生产动力学

发布时间:Mar 24, 2021         已有 人浏览
生物反应器规模生长与NMN生产动力学
在添加1%葡萄糖和1%NaM的LB培养基中,将规模培养提高到500 mL台架上生物反应器,提高了NMN的产量。E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS pET28a-hdNadV细胞是摇瓶培养的29倍。2)不添加葡萄糖,最高为20.79mm NMN(或每克蛋白质16.63mg NMN)。添加0.1%NAM和1%葡萄糖的培养基可使细菌细胞产生NMN增加32.7倍,最终值为23.57mm(即每克蛋白18.7mg)。3C,D)。为了评价NMN是否被活菌导入培养基或从死细胞中漏出,对NAM浓度和质粒进行了测定,测定了培养液(细胞外)中NMN的浓度。3A,B)在IPTG诱导培养中。在所有这些条件下,培养基中NMN的浓度均小于1×10。−2嗯。生长培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的释放水平(见图)。3G,H结果表明,添加0.1%NAM的细胞存活率较高,而携带双顺反子表达质粒的培养细胞死亡率较高。3G,H)。携带这两种质粒的细菌细胞表现出类似的葡萄糖摄取模式,每小时需消耗约1克/升葡萄糖,监测培养的生物反应器培养物的葡萄糖补充量、pH值和温度控制,以获得比通常在摇瓶培养时更高的细胞密度。而仅携带nadV基因的培养在两种浓度下均表现出相似的生长模式,而携带双顺反子质粒的培养细胞密度在1%NAM中达到较低的最大值(图一)。3 E、F).
 
不同NaM底物浓度在0~2.9%范围内,在0.1%NaM添加培养基中产生NMN产量高峰。5A).
 
图5
figure5
NMN产量E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS pET28a-baPrs-hdNadV在PYA 8+1%乳糖+指定NAM浓度下生长12小时(A);NMN的生产动力学E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS pET28a-baPrs-hdNadV在含IPTG、LB培养基+乳糖的LB培养基中,分别添加PYA 8+乳糖。在每种生长培养基中添加0.1%的NaM。据报道,每克细菌细胞的蛋白质中含有毫克NMN(B)和每升细菌培养的mg NMN(C).
 
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1%乳糖对1mm IPTG诱导的细菌NMN产量无明显变化。5)直到培养密度(OD)600 Nm)达到1.7,证实乳糖是一种较好但价格较低的IPTG替代品。OD后NMN浓度的急剧下降600 Nm=1.7可能是由于细菌代谢的乳糖耗尽所致。获得了更高密度的培养物,用PYA 8培养基代替LB,就像以前在塞拉利昂所显示的那样。等人.39。在较低的培养密度下,PYA 8+乳糖培养细胞的NMN浓度显著低于在LB+乳糖或LB+IPTG中生长的细胞,但在OD以上的培养密度下,NMN浓度显著低于在LB+乳糖或LB+IP600 Nm=1.9,PYA 8培养基产量最高,OD时NMN产量最高达15.42g/L(即每克蛋白质17.26mg NMN)。600 Nm=2.6(图1。5表1).
 
讨论
考虑到NMN在治疗II型糖尿病中的潜在影响,为了解决该化合物成本高的问题,我们提出了一种生物技术的NMN生产方法。E. 大肠杆菌,广泛应用于生物技术。除了一项显示酵母菌生产数据的专利外,我们无法在科学文献中找到这种化合物的任何生产方法。我们采用了直截了当的方法,即开发天然NAD。+通过NAMPT酶将NAM转化为NMN的打捞途径。但E. 大肠杆菌缺乏NAMPT酶。它为NAD提供了另一条救助途径。+从生物技术的角度来看,生物合成并不有趣,因为所涉及的中间代谢物比NAM更昂贵。30。按照生命之树33大多数表达NAMPT的微生物都是致病性的,或者以前没有在生物技术中使用过。由于没有发现关于这些酶的一般活性及其在E. 大肠杆菌我们决定从其中选择三种,并对它们的生产力进行比较评价。NadV基因的氨基酸序列比较杜雷嗜血杆菌, [医]雪旺氏菌和NAMPT基因[医]肌肉表明它们是高度保守的(附图)。沙一),但我们不能对他们的比较生产力作出任何假设。杜雷嗜血杆菌, [医]雪旺氏菌是因为他们接近大肠杆菌在生命之树上。将pNAD 1质粒转化为大肠杆菌DH5α株失败42,可能是由于密码子不可用或其他元素与大肠杆菌质粒pNAD 1中的菌株。因此,我们从数据库中取走(UniProt,登录号)。Np_957670.1)nadV氨基酸序列在pNAD 1质粒上进行,并在Genome Compiler软件v.2.2.55(Genome Compiler Corporation,2015年)中进行优化,以便在E. 大肠杆菌。在pET-28a+载体上克隆了这两种有机体nadV基因的dna序列。[医]肌肉可方便地在宠物-28a(+)上使用。E. 大肠杆菌表达载体在Addgene。
 
所有这些质粒都转化为长期保存在E. 大肠杆菌DH5α及其在BL 21(DE3)pLysS中的表达。琼脂糖凝胶电泳证实转化成功,转化后的细菌细胞中有6704 bp-6788 bp的条带(附图)。S2A)。PET28a-hdNadV和pET28a-sonadV质粒在三条带中的迁移与质粒dna的构象不同有关,在琼脂糖凝胶电泳中以不同的速度运行。43。与线性形式相比,超螺旋构象对应的带强度取决于质粒在纯化过程中所发生的操作次数。NadV/NAMPT重组酶经SDS-PAGE(附图)确证。S2D).
 
在科学文献中没有发现转化或未转化细菌产生NMN的培养基中NAM耐受性浓度的信息。因此,我们在摇瓶培养中对此进行了评价,发现5%NaM对细菌生长有抑制作用,1%对细胞生长有轻微影响,0.1%浓度对细胞生长有较好的耐受性。所有NAM补充培养物的加倍时间都比野生型长一倍。E. 大肠杆菌。观察到的生长减缓效应与NAM浓度有关(附图)。S3、图1.1)。这三种质粒和未转化细菌都有相同的表达模式,说明这是NAM的直接作用,而不是质粒或重组蛋白的直接作用。我们决定在0.1%和1%NAM添加培养基中进一步评价nadV/0NAMPT酶的产量。所有转化菌均产生较高的NMN细胞内浓度。基因杜雷嗜血杆菌(无花果)2)是生产效率最高的,因此被选择用于进一步评估最佳OD值。600 Nm诱导蛋白表达及优化OD值600 Nm为了文化收获。
 
NadV/NAMPT基因由PET-28a(+)载体介导,在T7lac启动子的控制下表达。大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS株携带T7 RNA聚合酶的基因组DNA编码序列。T7 RNA聚合酶和nadv/nmpt酶的转录受lac启动子控制,启动子仅在乳糖或其非代谢类似物iptg存在下启动转录。38。重组蛋白的基本表达被pLysS质粒的蛋白酶产物所抑制。SDS-PAGE上未见基础蛋白表达。S2D)。诱导蛋白表达的最佳细胞培养密度为OD。600 Nm=0.46。NMN产量在OD达到高峰600 Nm=2小时后为0.73。随后开始下降,细胞密度增加导致NMN产量降低(附图)。S4).
 
NAMPT催化NMN生物合成从邻苯三酚焦磷酸酯(PRPP)转移到烟酰胺(NAM)21。NAM通过直接补充培养基提供给细胞。用磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶,EC 2.7.6.1)合成了PRPP。扎卡塔耶娃等人.29表明PRPP合成酶的表达淀粉菌PET15b(+)载体L135I突变株IAM 1523E. 大肠杆菌导致PRPP生产过剩。我们怀疑较高密度培养的nmn下降可能是由prpp耗竭引起的,因此我们共同转化。大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS pET28a-hdNadV与pET15b-PRS135(Zakataeva N.,Ajinomoto-Genetika研究所-agri,俄罗斯莫斯科)赠送的礼物。这种方法没有产生预期的结果,与仅培养pET28a-hdnadv相比,nmn的产量下降了50%,这可能是由于增加了dna合成努力或缺乏大肠杆菌PET-15b(+)携带PRS L135I基因密码子优化(表)1)。然后构建了一个双顺反子载体,将含有L135I突变和密码子优化的baPrs基因插入到pET28a-hdNadV质粒中,如图所示。4.
 
在1%葡萄糖添加LB培养基的500 mL生物反应器中,比较NMN的产生动力学表明,pET28a-hdNadV转化细胞的最大NMN浓度是不加葡萄糖培养的29倍。在添加0.1%NAM和1%葡萄糖的培养基中,细菌细胞NMN的产量增加了32.7倍,达到每克蛋白质18.7mg的终值(见图)。3C,D)。可能在发酵过程中,一些细胞被溶解,因此在生长培养基中检测到少量的NMN。3A,B)。从LB培养基中摄取氨基酸后,细菌细胞每小时使用1 g/L葡萄糖(见图)。3 E、F)。在添加0.1%的LB培养基中,乳酸脱氢酶(LDH)的释放量与1%的NAM(图1)相比有显着性差异。3G,H)证实在0.1%NAM培养基中具有较高的细胞活力。单顺反子(pET28a-hdNadV)和双顺反子(pET28a-baPrs-hdNadV)转化细胞在0.1%NAM中的生长模式和葡萄糖摄取几乎相同。1%NaM对携带双顺反子质粒的细胞毒性更大,生长培养基中LDH和NMN浓度均较高。3B,D).
 
从生物技术的角度来看,随着NMN浓度的不断升高,双顺反子质粒的生产模式比单顺反子转化细胞的最大产量峰值更有利。如果不是不可能的话,很难准确地在浓缩峰上收获。因此,一个不断上升,可预测的模式,如携带双顺反子载体的细胞所显示的(如图所示)。3C),即使最大浓度略低,也是可取的。
 
虽然葡萄糖培养表现良好,但利用IPTG诱导蛋白质表达在生物技术中是不可取的,因为它非常昂贵。乳糖可以替代,但细菌消耗它作为碳源(图一)。5)。为了避免乳糖耗尽时的产量下降,在生长过程中应不断添加乳糖。为了解决这个问题,我们用含有乙酸酯的PYA 8培养基取代LB,这是比乳糖更好的碳源。PYA 8也是一种缓冲,简化了工艺设备,因为pH补偿不再是必要的,它不泡沫,而且更便宜。
 
由于0.1%和1%NaM的产率都是可以接受的,从产品纯化的角度来看,较低的NaM浓度是可取的,而较高的NaM浓度则可能导致较高的产率。0.03%NaM比不含NaM的培养基产生5倍以上的NMN,NMN浓度先上升到0.1%的NAM浓度点,然后开始下降。从1.3%NaM开始,细菌生长受到严重损害,我们的结果表明,较高的NAM浓度对该菌株是有毒的。5A).
 
此前唯一公布的NMN生产方法显示,酵母经10 kDa膜过滤后,其产量从每克蛋白质5毫克到“50毫克以上”不等。41。除未指定的最大值外,10 kDa膜随着较大分子质量和不溶性蛋白质及复合物的过滤,大大降低了此浓度所对应的蛋白质含量。因此,我们认为我们每克蛋白质17.26mgNMN的值为原细胞裂解全蛋白含量的最佳报告。
 
由于生长介质的低成本、所需的简单和廉价的加工设备,NMN的价格可能会降低到适合于治疗人类2型糖尿病和与衰老有关的疾病的水平。
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